吸入制劑是利用特殊裝置，將溶解或分散于適宜介質中的原料藥物霧化后，通過使用者主動或被動吸入氣溶膠或蒸氣的形式的藥物至肺部，進而發揮局部或者全身作用的固體或液體制劑。目前，臨床上的吸入制劑按給藥形態主要可分為干粉吸入劑、吸入粉霧劑、吸入噴霧劑和吸入液體制劑。吸入制劑可直接到達肺部病灶等目的暴露部位，吸收快起效快，避免口服給藥的首過效應，且具有便攜性好和病人服藥的依從性好等特點。近年，隨著吸入制劑的快速發展，吸入治療被世界衛生組織WHO和歐美推薦為哮喘、慢性阻塞性肺病（COPD）等呼吸道疾病治療的首選給藥方式，并且針對吸入給藥制劑PK研究的評價方法和手段也有了長足的進步。
圖1 臨床上常見的吸入制劑
1.吸入給藥PK特點
不同于常規給藥制劑（口服制劑、注射劑等），吸入制劑進入循環系統主要有兩條途徑：第一條為部分藥物經肺部吸入后，經過黏液層、上皮細胞、基底膜、間質組織吸收入血；第二條為其余部分藥物沉積于口腔，通過吞咽至胃腸道吸收入血。藥物在肺部吸收的方式包括被動擴散、主動轉運、細胞旁路轉運、淋巴細胞吞噬等，一般來說，藥物霧化后的粒徑大小和理化性質對吸收方式及吸收部位有較大影響，如脂溶性較大的藥物吸收方式主要為被動擴散。
圖2吸入給藥體內處置過程
對于治療肺部疾病的肺吸入制劑，其有效性主要取決于沉積在肺部的藥物量，而其安全性需要考慮兩個方面，包括局部安全性和全身安全性。由于肺部藥物代謝與肝腸代謝存在較大差異，肺部酶活性普遍較低，且表達模式也不同，因此需要特別關注藥物在肺部代謝物的暴露量、藥物間的相互作用、以及藥物是否可被肺部代謝酶活化等，以更好地評估其治療效果或毒性反應。
2. 吸入制劑非臨床PK研究的特殊關注點
2.1 指導原則
對于人用藥，目前沒有針對吸入給藥途徑的指導原則，對于化學品或農藥，有少數指導原則或標準指南；經濟合作與發展組織（OECD）化學品關于吸入給藥的內容是各國指導原則中技術要求最詳細，涵蓋范圍最廣，要求最高的指導原則，也是吸入制劑非臨床PK研究中必須關注的指導原則。
圖3 OECD化學品相關指導原則
2.2 動物種屬的選擇
吸入制劑非臨床藥動學研究的動物種屬選擇的基本原則與其他制劑基本相同，一般采用健康、成年的動物進行。在考慮與人體PK性質相關性的前提下，盡可能選擇與毒理學和藥效學研究相同的動物。對于系統暴露量較高的吸入制劑，代謝產物譜可提供動物種屬選擇的關鍵性依據；對于局部暴露為主的吸入制劑，需關注局部組織特征或細胞類型與人體的相似度。此外，還需重點評估動物呼吸道解剖結構對預測人體結果的影響，以及給藥過程中動物的依從性。動物的呼吸道解剖結構決定受試物的分布沉積特征和給藥難度在候選藥物篩選、劑量探索等早期研究。創新性藥物應選用兩種或兩種以上的動物，其中一種為嚙齒類動物，另一種為非嚙齒類動物。非創新性藥物，可選用一種動物，建議首選非嚙齒類動物。在藥物開發初期，大鼠是吸入制劑非臨床藥動學研究中最常用的動物，可用于候選藥物篩選、劑量設計等。在動物數量確定方面，由于吸入制劑的實際給藥劑量受諸多因素影響，包括給藥裝置的因素和動物自身呼吸狀態等因素，難以測量和消除動物呼吸狀態個體差異帶來的誤差，因此，可較常規給藥途徑適當增加動物數量。
2.3 給藥方式的選擇
動物吸入給藥方式包括口鼻吸入給藥、氣管給藥、壓縮霧化給藥，各有優缺點。氣管給藥可以精確定量給藥，但需在麻醉狀態下給藥，常用來開展探索性試驗。口鼻吸入給藥與實際臨床給藥方式相近，可以評估藥物在上呼吸道的暴露情況，無需麻醉，且一次可進行多只動物給藥，是申報藥代研究常用的給藥方式。壓縮霧化給藥與臨床給藥方式最相近，但無法評估實際給藥劑量。
表1 動物吸入給藥方式
|
給藥方式 |
動物
類型 |
動物
麻醉 |
血液樣品采集 |
氣溶膠采集 |
粒徑監測 |
藥物量 |
給藥難度 |
動物數 |
|
氣管給藥 |
小動物 |
需要 |
隨時采集 |
不可以 |
不可以 |
少 |
適中 |
一次1只 |
口鼻吸入
給藥 |
大、小動物 |
不需要 |
隨時采集 |
可以 |
可以 |
多 |
較難 |
一次多只 |
壓縮霧化
吸入 |
小動物 |
不需要 |
不可以隨時采集 |
不可以 |
不可以 |
少 |
簡單 |
一次1只 |
圖4 動物吸入給藥示意圖
2.4 受試物分析——給藥準確性監測
為了確保在吸入給藥時遞送藥物的準確性，在給藥期間需對藥物遞送劑量、遞送均一性和穩定性及空氣動力學粒徑分布進行監測。在非臨床研究階段，通常在正式給藥前需對霧化生成方法及含量檢測方法進行受試物分析考察和驗證。受試物分析是吸入給藥制劑非臨床評價中的一個重點和難點。受試物分析除了常規給藥制劑評估的給藥制劑的濃度、均一性和穩定性外，還需檢測和驗證氣溶膠顆粒的空氣動力學粒徑、遞送劑量、沉積劑量、給藥過程中氣溶膠濃度的穩定性、不同給藥批次間氣溶膠濃度的穩定性和均一性等。吸入制劑的給藥劑量會隨動物狀態、給藥裝置的穩定性、環境參數等改變，因此通常根據藥動學探索研究來設定劑量。
遞送劑量的監測
吸入制劑的非臨床PK研究常通過采樣瓶或合適的濾膜采集一定時間內任意霧化通道霧化后的氣溶膠顆粒（一般連續多次采集）并通過高效液相色譜儀等方法檢測采樣瓶或濾膜中的藥物濃度，換算成氣溶膠中的藥物濃度，即可獲得一定霧化時間內的藥物劑量。對于液體制劑（氣霧劑和噴霧劑），通常采用高效液相色譜法、氣相色譜法等方法檢測有效成分的含量。對于無揮發性的單一化合物，可采用稱重法進行氣溶膠濃度的檢測。OECD對液體和固體型氣溶膠濃度的允許偏差為±20%。
遞送穩定性和均一性的考察
吸入制劑在持續霧化一定時間后，通過間斷采樣和檢測，可考察持續霧化的穩定性。通過對霧化通道進行分通道采樣，采集多個通道的樣品進行檢測，可考察各霧化通道間的均一性。對于多層的小動物單濃度口鼻動態暴露吸入系統，還需對各層霧化通道進行分通道采樣和檢測，以考察各層霧化通道間的均一性。霧化后各時間點和各通道的藥物濃度均應在目標濃度的±20%范圍內。
空氣動力學粒徑分布的監測
氣溶膠中藥物顆粒的粒徑分布是影響藥物在呼吸道和肺部沉積的關鍵參數，因此，空氣動力學粒徑分布是給藥過程中質量控制的重要指標之一。粒徑分布可通過多種測試方法定期檢測，測試方法主要包括碰撞法、激光衍射法和飛行時間粒徑分析法，前兩種方法較為常用。臨床上，FDA建議采用至少兩種原理的檢測方法進行空氣動力學粒徑分布的研究，且其中一種必須采用多級碰撞法。碰撞法是目前吸入制劑體外粒度分析最經典的方法，也是美國和歐洲藥典評價吸入制劑體外粒度分布推薦使用的方法。比如《中國藥典》收載的雙層液體碰撞器，美國、歐洲藥典收載的Andersen多級撞擊器、Marple miler 多級撞擊器等。近年來，新一代多級慣性碰撞器使用普遍，質量中值空氣動力學直徑（MMAD）和幾何標準差（GSD）等常用來作為評價參數。
圖5 給藥準確性監測常用儀器
2.5 樣品采集
樣品采集除了常規的血漿采集外，需要特別關注藥物的呼吸道藥物分布以及灌洗液中的藥物濃度。在血樣采集時，對于吸收迅速、半衰期短的藥物需考慮給藥中采血，且需注意防止交叉污染。在進行組織分布研究時，除采集心、肝、脾、腎、腦等主要組織器官外，還需關注呼吸系統組織器官如鼻咽（含鼻甲）、喉部（含會厭）、主氣管、支氣管、肺臟及肺灌洗液中藥物的分布，且灌洗液采集體積和停留時間需保持一致性，小組織如鼻粘膜、咽、喉、氣管、支氣管的采集方法也要保持一致性。
2.6 生物樣品分析
生物樣品的分析方法包括色譜法、免疫學法、放射性同位素標記法和微生物學方法等。其中色譜法包括高效液相色譜法、氣相色譜法和色譜-質譜聯用法；免疫學法包括放射免疫分析法、熒光免疫分析法、酶免疫分析法等。由于生物樣本藥物濃度低、樣品量少、內源性物質干擾多且個體差異大，應根據藥物的性質、生物樣品中藥物的濃度選擇不同的檢測方法。對于
系統暴露量低的吸入給藥制劑需盡早開發靈敏度足夠的方法
圖6 液相色譜質譜聯用儀
3 案例分享
LW23122是口服改吸入的改良型干粉吸入制劑，以期達到起效快、作用時間可控、提高生物利用度等效果。在開展的大鼠口鼻暴露吸入給藥血藥濃度-時間曲線試驗研究中，試驗選用30只SD大鼠，設單次吸入低、中、高劑量組（A、B、C）、多次吸入組（D）、原研經口組（E），受試物低、中、高劑量組及多次給藥組動物均采用精準氣溶膠吸入給藥系統給藥，給藥時將大鼠放進固定器中進行吸入給藥，使用UPLC定量檢測截留藥物量。受試物低、中、高劑量組單次吸入給藥時長分別為5min、10min、20min，實際遞送劑量分別為0.06mg/kg、0.14mg/kg、0.28mg/kg。多次給藥組吸入給藥時長為10min，實際遞送劑量為0.15mg/kg，連續給藥7天；原研經口組單次灌胃給予1.8mg/kg的原研片劑。受試物中、高劑量組動物于給藥前、給藥中和給藥后采血；多次給藥組于第7天給藥前，給藥中和給藥后采血；受試物低劑量組、原研經口組于給藥前和給藥后采血。各組動物均于給藥前（0h）采集血樣；受試物中劑量組動物于給藥中5min，受試物高劑量組動物于給藥中10min，多次給藥組動物于第7天給藥中5min采集血樣；受試物低、中、高劑量組均于單次給藥后0h、0.083h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、24h采集血樣，多次給藥組于第7天給藥后0h、0.083h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、24h采集血樣，市售對照品組動物于單次給藥后0.083h、0.167h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h采集血樣。采用經驗證合格的LC-MS/MS方法檢測血漿中LW23122的濃度。使用Phoenix WinNonlin（V 8.1.0.3530）軟件對得到的藥物濃度進行主要藥代動力學參數T
max、C
max、t
1/2、AUC
(0-t)、MRT
(0-t) 統計分析。
吸入給藥后，實際遞送劑量比值與吸入給藥時長比值（1:2:4）基本一致，說明動物吸入給藥系統穩定。受試物低、中、高劑量組體內藥物的暴露量AUC
(0-t)和達峰濃度C
max不同劑量組間的比值與實際遞送劑量比值基本一致，多次給藥后，未見蓄積。受試物中劑量組（0.14mg/mL）體內藥物暴露量AUC
(0-t)與原研經口組（1.8mg/kg）SD大鼠相當，受試物中劑量組T
max明顯短于原研經口組的T
max，提示相比于口服給藥，吸入給藥起效快，提高藥物的生物利用度。
圖7 LW23122吸入給藥血藥-濃度時間曲線圖
4 結語
非臨床PK研究在藥物研發早期的有效性和安全性評價中有著舉足輕重的作用，對于肺部吸入制劑這種特殊的給藥劑型，盡早開展PK研究尤為重要。萊恩醫藥已成功建立大小動物吸入制劑給藥平臺，擁有先進的吸入給藥實驗設備和技術以及經驗豐富的研究團隊，已完成多個吸入制劑的藥效、藥代和毒理研究，順利完成IND申報。
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